新藥開發(fā)的過程是漫長、復雜和不確定的，高通量篩選(High-throughput screening，HTS)是小分子藥物設計中用于發(fā)現起始化合物的策略之一。一般來說，當對靶標研究較少時，HTS是首選。根據與疾病的相關性，綜合考慮與其他靶標的聯(lián)系以及創(chuàng)新性，來進行HTS的靶標或細胞模型的選擇。篩選技術的選擇是由靶標的可篩選性及其假定的化學易變性決定的。不同的篩選技術適用于不同的靶標，對篩選技術的評述對之后的HTS具有重要的指導作用。
進行HTS有一定的先決條件，首先是靶標的前期確證，其次是靈敏且穩(wěn)定的篩選方法，最后是結構豐富的化合物庫。在HTS后，還需要對苗頭化合物進行進一步的確證。常用的方法是重新購買，確認純度，測定親和力和濃度梯度實驗，進行多方法的實驗檢測，再去卷積分析排除假陽性。還可以利用靶標蛋白的同源家族蛋白突變體等備選進行特異性篩選，多向印證化合物的選擇性。
一、生化篩選體系
生化篩選利用純化的靶標蛋白，在體外測定配體的結合或酶活性的抑制。這些分析通常采用競爭形式進行，即研究中的化合物必須取代已知的配體或底物。通常使用384孔板進行檢測，一般采用20-50 μL的檢測體積，并使用光學方法讀出，如吸光度，熒光，或發(fā)光。熒光法由于其更易操作、高靈敏度和靈活性，已經在很大程度上取代了傳統(tǒng)的放射性標記配體分析方法。常用的熒光檢測方法有以下幾種：
1.總熒光分析（Fluorescence intensity, FLINT）
在固定時間內對孔的熒光值進行積分如100 ms。常用于含染料的底物，在酶催化反應后生成具有熒光的物質，如蛋白酶介導的肽熒光基團的裂解。FLINT會受到許多因素的影響，如被檢測物質的自發(fā)熒光和淬滅（與被檢測物質相互作用而非底物）以及加樣誤差等。一般來說，用于標記的染料的激發(fā)波長越長，從篩選化合物的光譜干擾就越小。
2. 熒光比率法（Ratiometric fluorescence methods）
常見的HTS篩選體系包括熒光偏振（FP）和熒光各向異性（FA）檢測。此方法相較FLINT更不易受人為因素的影響，通過測定分子一定時間的旋轉變化，表征相互作用對測定分子的影響。在這些技術中，使用偏振光來激發(fā)熒光團，并使用平行于和垂直于入射光偏振的偏振器來測量熒光發(fā)射。當染料標記的分子隨時間翻轉時，發(fā)射信號會去偏振。與大分子的結合降低了熒光團的遷移率，從而增加了偏振值或各向異性，并允許定量結合。因為不同熒光素的熒光壽命不同，利用此特性可以最大化篩選體系的靈敏度。有機染料如fluorescein和rhodamine熒光壽命約3-4 ns，當它們與約0.5-10 kD的分子結合時，檢測靈敏度最高。所以熒光比率法最適合用于分子量差異很大的分子間相互作用的測定。
3. 熒光共振能量轉移（FRET）
來自熒光供體的能量通過偶極-偶極相互作用被受體吸收。能量傳遞的效率取決于供體和受體之間的光譜重疊，它們的距離和相對方向，以及福斯特方程中的其他參數。常見的能量供受體距離是26 nm，適合許多蛋白-蛋白相互作用。
4. 時間分辨熒光共振能量轉移（TR-FRET）
是由熒光共振能量轉移衍生而來的一種篩選方法。具有長壽命熒光(通常為100秒到毫秒)的鑭系化合物用作熒光供體，熒光蛋白或有機熒光團(例如，別藻藍蛋白或Cy5)用作受體。然后對受體的熒光發(fā)射進行門控(例如，延遲到50ms)，以便在信號采集時，被測化合物中短壽命有機熒光團的熒光發(fā)射已經衰減。典型的商業(yè)化合物庫里分子熒光壽命在皮秒范圍內。此外，350 nm供體激發(fā)和670 nm受體發(fā)射之間的大斯托克斯位移進一步有助于最小化背景信號。鑭系化合物的熒光發(fā)射也表現為多個窄波長，這與有機染料的寬波長發(fā)射不同，后者允許與熒光受體進行多路復用。
5. 熒光壽命分析（Fluorescence lifetime analysis, FLA）
一種不太常見但有效的檢測方法，在高通量篩選中，FLA使用時域數據采集來確定樣品中存在的熒光物質的壽命。FLA的理想染料是釕絡合物，其熒光壽命約為20 ns。與熒光強度的測量相比，壽命測量對樣品中其他材料的顏色(如測試化合物)的敏感性要低得多。此外，在分析數據時，兩種生命周期通常都適用，這允許刪除壽命較短的組分，類似于TR-FRET實現的效果。
6. Alphascreen
熒光發(fā)射的波長比激發(fā)光的波長長，與其相反，AlphaScreen是一種非放射性的基于距離的分析方法，使用單線態(tài)氧敏化在較短的波長上產生發(fā)射，從而避免熒光偽影。待測分子偶聯(lián)在兩種不同的水凝膠包覆微珠上。供體微珠含有光敏劑(酞菁衍生物)，當被680 nm的光刺激時產生單線態(tài)氧。如果受體微珠(包含二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物)貼近供體微珠，導致化學發(fā)光和短的波長的光發(fā)射(520-620 nm)。
二、基于親和力的篩選體系
基于結合的分析直接觀察庫里化合物與目標蛋白的結合，而不考慮它們對蛋白質功能的影響。上文所述的生物化學方法則是測量酶/受體功能的改變或探針/蛋白質結合的抑制。一般來說，基于結合的測定法使用的生物物理技術比基于競爭的篩選法更耗費材料和時間，因此最常用于小型化合物庫?；诮Y合的方法也被用于具有挑戰(zhàn)性的孤兒靶點和藥物發(fā)現過程的后期階段，如苗頭化合物驗證、優(yōu)化和先導化合物的優(yōu)化。
1. 基于片段的藥物設計(Fragment-based drug design, FBDD)
一種特別適合生物物理方法的應用。FBDD涉及片段的篩選，這些片段是小分子(<280 Da)，與蛋白質形成弱相互作用，典型的解離常數在毫摩爾到微摩爾范圍內。FBDD利用小化合物庫覆蓋更大的化學空間(例如,使用103的片段可能達到105 -106年傳統(tǒng)的HTS化合物庫的效果)，同時為藥物化學提供了一個靈活的起點。片段發(fā)現對于靶向蛋白質-蛋白質相互作用和傳統(tǒng)化合物庫作用有限的難成藥靶標特別有幫助。FBDD中最常用的方法是NMR(核磁共振)、表面等離子體共振和X射線晶體學。
2. 核磁共振（NMR）
NMR可用于配體檢測和蛋白質檢測兩種模式。配體檢測的核磁共振測量在目標蛋白存在時，配體質子或其他核磁共振活性核的強度或弛豫的變化，通過從蛋白質到配體的磁化轉移，稱為奧氏核效應。通常使用1H-NMR，使用配體檢測模式，對蛋白質沒有大小限制，只需要低濃度的蛋白質，也不需要同位素標記。但另一方面，基于配體的NMR可能無法區(qū)分特異性和非特異性的結合作用。雖然蛋白質檢測核磁共振更費力，但它提供了化合物結合位點的具體信息，特別是當核磁共振峰被分配到特定的蛋白質殘基時。因此，在初次篩選后，蛋白質檢測NMR通常作為二次檢測。蛋白質檢測NMR最常用的方法是1H-15N和1H-13C異核單量子關系(HSQC)，它們分別對蛋白質主鏈或含甲基側鏈的化學環(huán)境變化非常敏感。最近，反膠束封裝已被提出，以擴大核磁共振在FBDD中的檢測限度，這可能允許測量離解常數超過200 mM。
3. 表面等離子體共振（SPR）
一種非常靈敏的方法來實時監(jiān)測兩個物種之間的結合，且可進行高通量篩選。SPR測量金/玻璃/溶劑界面的折射率變化，即光在表面等離子體上損失的角度(“SPR dip”)。在典型的SPR實驗中，小分子或蛋白質流過靶標或其他結合物質被固定的表面。重要的是，折射率的變化與結合材料的質量成正比；因此，SPR可以測量結合化學計量學和結合動力學。通常，靶蛋白被固定在傳感器上，使用賴氨酸的共價連接或通過親和捕獲方法，如多組氨酸標簽、生物素或Fc受體。這種形式允許每天測量數百個分子，但這可能受到蛋白質穩(wěn)定性的限制?；蛘撸㈥嚵泄潭ɑ衔镂膸焯峁└叩耐?，但需要對文庫進行化學修飾以固定化。為了區(qū)分特異性和非特異性結合，可以對已知配體進行競爭實驗或對蛋白質進行突變驗證。雖然SPR非常敏感，但它相對昂貴，需要嚴格控制緩沖液、溫度和懸浮顆粒物。
4. 生物膜層干涉（Biolayer interferometry, BLI）
與SPR原理類似，測量固定蛋白層與內部參考層之間的信號干涉。這種技術更容易使用，但比SPR不敏感，因此通常用于測量蛋白質之間的相互作用，而不是蛋白質與小分子之間的相互作用。
5. 二次諧波產生（Second-harmonic generation, SHG）
另一種基于板的測量親和力的方法，測量384孔板中固定在脂質雙分子層上的染料標記蛋白的內部總反射率的變化。信號的二次諧波分量對二次諧波活性染料(PyMPO衍生物)相對于表面的取向非常敏感(具有亞埃分辨率)，當配體與目標結合并改變其構象時，信號的二次諧波分量會發(fā)生變化。因此，SHG能夠在化合物庫中篩選變構或誘導構象改變的分子。
6. 質譜分析（MS）
廣泛用于篩選蛋白質和小分子間的相互作用。一種常見的形式是親和選擇-質譜(AS-MS)，其中蛋白質和化合物池孵育，蛋白質配體配合物從未結合的化合物中迅速分離，結合的配體然后用LC-ESI-MS解離和鑒定。蛋白質配體配合物與未結合配體的分離可以通過多種方法實現，如超濾或分子排阻層析。另外，蛋白質分子加合物也可以在特定的環(huán)境下用質譜進行測量，如二硫鍵結合化合物或共價化合物的篩選。
7. 熱漂移實驗（DSF）
差示掃描熒光法（DSF）和熱漂移實驗（Thermal shift assay, TSA）都是指的這一方法，通過檢測溫度升高時染料的熒光增加，測定蛋白質的去折疊，這種染料與蛋白質的疏水部分有親和力，當蛋白質展開時，疏水部分暴露出來，熒光增強。與目標物結合的化合物使其穩(wěn)定并提高熔解溫度。
8. DNA編碼化合物庫（DNA-Encoded Library technology, DEL）
DEL是通過一種均分與合并的方法建立的，化學支架混合在一起，然后分開進入容器為下一輪化學反應。在每個容器中加入不同的化學取代物，然后再次合并和均分，以進行下一個反應。裂解池化學的產物是一種復雜的混合物，它可以包含數百萬甚至數十億種化合物。對于DEL，開始的支架被標記為獨特的DNA序列;在每個反應步驟中，添加另一個DNA序列，作為添加的化學取代基的條形碼。然后，DNA條形碼編碼的混合物被應用到含有感興趣的蛋白質的微珠上。沖洗掉未結合的化合物，洗脫結合的化合物，并進行PCR和二代測序，以確定哪些DNA偶聯(lián)化合物與蛋白質結合。
9. X射線晶體衍射（X-ray crystallography）
研究小分子/蛋白質復合物的高分辨率方法。雖然X射線晶體學需要最多的蛋白質(毫克)和結晶是耗時的，但它可以極大地促進配體的結構導向設計，以改善親和力。目前高通量結晶方法已經開發(fā)出來，并且衍射也有相應的高通量設施，不過主要依賴于化合物浸泡（Soaking）的方法實現。
三、基于細胞的篩選體系
化學探針和藥物先導的發(fā)現不僅可以基于與特定靶標的相互作用，也可以基于它們誘導細胞/生物體表型的能力?；诩毎?生物體的篩選通常使用在1）理想的分子靶標是未知的；2）生化方法不能充分重現靶標反應體系；3）理想的表型只存在于細胞背景下，如細胞分化等。功能性結果還可以提供大量的機制信息，如區(qū)分完全激動劑，部分激動劑，反向激動劑和變構調節(jié)劑。異質性也可以被測量，特別是當細胞可以可視化高內涵成像時。最后，基于細胞的方法還可以報告化合物的膜通透性和細胞毒性，這是基于結構的藥物開發(fā)失敗的主要原因。
基于細胞的方法可以應用在藥物發(fā)現的整個進程中：靶標識別和驗證、初篩、先導鑒定、先導優(yōu)化以及安全性和毒性篩選。常用的方法如下，細胞增殖、第二信使、報告基因、蛋白質片段互補、酵母雙雜法和基于顯微鏡的分析。細胞模型的選擇是至關重要的。人源建模中，細胞系通常被改造帶有報告基因或者其他特征。目前趨勢更多的是建立“疾病樣”模型，包括原代/患者來源的細胞和涉及3D細胞培養(yǎng)或多細胞種類的復雜培養(yǎng)。人們對使用灌注培養(yǎng)和其他微流體裝置來評估化合物對細胞的長期影響也越來越感興趣。此外，小動物模型，如線蟲和斑馬魚越來越多地被用作小分子篩選的高通量模型。
1. 細胞增殖（Cell viability）
細胞增殖常用于鑒定能殺死癌細胞或病原體的化合物，并可檢測在肝臟等器官中的潛在安全問題。常用有效的活性測定方法是利用熒光素酶/熒光素在ATP依賴的反應中發(fā)光來測定ATP含量。熒光素酶的檢測非常敏感(每孔可以檢測到少于10個細胞)，可以適用于1536孔板。染料如釕、阿爾瑪藍、雙偶氮化合物（MTT、MTS、XTT和WST-1）也可用于增殖測定，這些通常轉化產生熒光或者顏色來表明存活或者死亡。細胞活力也可以通過檢測培養(yǎng)基中釋放的胞內酶（蛋白酶，LDH）或用非膜熒光染料插入DNA（如碘化丙啶）來評估。
2. 報告基因（Reporter gene）
報告基因分析(也稱為信號通路分析)，報告蛋白的編碼序列是在相關通路的轉錄控制下引入的。報告基因的表達通過檢測發(fā)光或熒光，反映啟動子激活或抑制的程度。觀察到的信號是整個通路的產物，被篩選的化合物可以在任何一點相互作用。常用的報告基因是CAT(氯霉素乙酰轉移酶)、GAL(β-半乳糖苷酶）、LAC(β-內酰胺酶)、LUC(熒光素酶)和GFP。報告基因方法的一個缺點是，它們通常需要長時間培養(yǎng)才能轉錄和翻譯，因此增加了間接影響的可能性。最新的發(fā)展方法是使用不同的報告基因來同時檢測多個通路。
3. 第二信使（Secondary messenger）
第二信使法檢測信使分子在通路中的表達或運輸，比報告基因法提供更相近的響應。這種檢測被廣泛用于GPCR靶標。例如，如果靶標激活細胞內Ca2+存儲，其活性可以直接使用鈣敏感染料(如氟-3，氟-4，基于水母發(fā)光蛋白的發(fā)光)測定。如果GPCR不能自然地調節(jié)細胞內Ca2+水平，它可以被設計成使用混雜或嵌合G蛋白(也被稱為通用適配器)刺激Ca2+信號。這些方法的一個特點是其快速的響應時間，這需要在以秒的數量級內整板注入化合物并CCD檢測，如FLIPR或FDSS。較慢的讀出分析，如arrestin或TANGO，也被開發(fā)用于GPCR篩選。熒光測定法已被開發(fā)用于測量其他信使，如K+，或其熒光信號隨膜電位變化的膜結合染料。
4. 蛋白質片段互補分析和雙雜交篩選（Protein-fragment complementation）
蛋白質片段互補分析(PCA，也被稱為雙分子熒光互補)和雙雜交篩選可以檢測細胞中蛋白質-蛋白質相互作用的形成/抑制。PCA將單個檢測蛋白(熒光素酶，GFP, GAL)分成兩部分，融合到感興趣的蛋白質互作分子上；如果伴侶結合，檢測蛋白重新形成，信號可被檢測到。在小分子篩選中，不可使用GFP，因為這兩個片段不可逆地結合，不能通過小分子的結合而解離。最近一種可逆性熒光互補結構被報道，其通過一種結合小分子染料的蛋白，增強熒光。雙雜交(2H)篩選是另一種基于活性轉錄因子形成的互補方法。在雙雜中，DNA結合域與誘餌蛋白結合，而轉錄激活域與靶蛋白結合。報告基因(如GAL或LAC)插入啟動子后，如果靶蛋白與誘餌結合，激活域與報告基因相連，激活報告基因并能被檢測到。在存在抑制蛋白質互作的化合物時，激活被阻止。
5. 高內涵顯微成像（High-content imaging）
HCS儀器自動收集在多孔板中生長的細胞的光學或熒光圖像;然后，這些圖像會自動分析所選擇的任何可測量特征。典型的儀器可以讀四色熒光2- 40倍的目標。寬視野和共焦工具都是可用的，頂級設備可以讀取到63倍的水浸目標。在獲得圖像后，使用定量的圖像分析工具提取特征，并將其轉換為數字數據?？蓽y量的特征非常多。例如，從單一的DNA結合染料，可以測量核的大小、形狀、強度和紋理(像素到像素的可變性)。
四、靶標識別
在通過基于表型的方法鑒定出有希望的先導化合物系列之后，需要鑒定出相應的靶標。這些技術通常用于開發(fā)中的臨床前分子，但同樣可以應用于已批準的目標未知的藥物。識別一種化合物的靶標將大大有助于理解其生理相關性，優(yōu)化其親和力，確定脫靶效應，以及獲得新藥物的監(jiān)管批準。靶標去卷積方法可分為三大類:化學蛋白質組學、化學遺傳學和生物信息學比較法。一般來說，這些方法的結果是通過敏感的體外試驗驗證的，如SPR。
1. 化學蛋白質組學（Chemical proteomics）
基于親和的方法是最古老和最直接的方法來闡明小分子靶標。在一種流行的形式中，配體被固定在載體上(如磁珠)，與細胞裂解液孵育，使其與蛋白質組相互作用。結合蛋白被洗脫，用胰蛋白酶消化成多肽，用液相色譜分離，然后用質譜和生物信息分析(鳥槍法蛋白質組學)鑒定。定量質譜蛋白質組學允許比較由生物活性配體拉下的蛋白量與那些結合到非活性的配體類似物(陰性對照)，從而區(qū)分非特異性結合。其他以親和力為基礎的形式也有報道，其中一些涉及到蛋白陣列的標記，而不是配體，使用凝膠電泳進行蛋白分離，或對配體進行化學修飾，使其能以共價方式附著在細胞中的目標物上。
基于親和分離的一個缺點是固定化和衍生化可以影響觀察到的結合親和。標記也需要化學合成的專業(yè)知識，也可能不兼容所有的配體。在基于活性的蛋白質分析(ABPP)中，配體與探針競爭與特定靶標類的成員結合。細胞熱漂移試驗(CETSA)由熱漂移試驗衍生來的，其中化合物被添加到細胞中。細胞或裂解物被加熱到不同的溫度，并監(jiān)測蛋白質的變性。配體的結合穩(wěn)定靶標蛋白，使它們在較高的溫度下才熔解。CETSA可通過凝膠電泳或質譜檢測。
2. 生物信息學分析（In silico comparative profiling）
可以將所研究的分子對細胞表達譜或表型的影響與已知生物活性小分子參考數據庫中的分子進行比較，從而推斷出實驗分子的靶標和作用機制。可用于比較的表型譜包括遺傳、轉錄組、蛋白質組和高內涵顯微鏡數據。
3. 化學遺傳學（Chemical genetics）
化學遺傳方法確定基因表達水平如何改變化學制劑的效果。特別是，可以在全基因組范圍內增加或減少基因產物的表達，并監(jiān)測配體誘導的表型變化。與其他靶標去卷積策略相比，這提供了獨特的優(yōu)勢，如不局限于可溶性蛋白，并允許區(qū)分直接和間接結合物，這為藥物的作用機制提供了更深入的了解。最初，化學遺傳學研究在有限數量的唯一可行的生物模型像酵母利用包含基因片段的多拷貝質粒，或通過比較減少基因的拷貝數的影響。如今，化學遺傳技術包括RNA干擾(RNAi)、條形碼開放閱讀框(ORF)庫和CRISPR篩選，這些技術能夠以系統(tǒng)和有效的方式干擾哺乳動物細胞中的所有基因?；贑RISPR和RNAi的方法都適用于匯集篩選，因為這兩種系統(tǒng)(sgRNA或shRNA)的表達結構都有DNA副本整合到基因組中，它們本身作為分子條形碼，為目標基因編碼。
五、未來與展望
進行藥物開發(fā)目前有兩條熱門的途徑，其一是根據基礎研究選擇具有重大意義的疾病靶標，特異性設計HTS的篩選方法，選擇合適的靶向藥物庫進行篩選，利用多重方法進行苗頭化合物和先導化合物的鑒定與驗證。其二是根據疾病特征性選擇合適的表型模型，根據表型的特征性，選擇合適的表型篩選體系進行表型篩選實驗，獲得先導化合物后進行靶標去卷積鑒定和驗證作用靶標，可再結合基于結構的藥物篩選進行進一輪的結構優(yōu)化提升藥效，綜合各藥物設計策略的長處，開發(fā)原創(chuàng)新型藥物。
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